哈工大全媒体（梁英爽 于领/文 于领/图）我校生命科学和医学学部/生命科学中心黄志伟教授团队在揭示Anti蛋白抑制Cas9新机制方面取得重要进展。1月19日，相关成果以《Anti-CRISPR蛋白通过靶向RNA支架抑制Cas9活性进而指导设计增强型基因编辑工具》（An anti-CRISPR targets the sgRNA to block Cas9 and guides the design of enhanced genome editors）为题发表在《自然结构和分子生物学》（Nature Structural & Molecular Biology）上。该研究揭示了Anti-CRISPR蛋白AcrIIA27广谱抑制Cas9核酸酶活性的分子机制，为精准调控CRISPR-Cas9活性提供了新理论依据，并基于AcrIIA27抑制的机制开发出活性增强的基因组编辑工具。
细菌通过CRISPR-Cas适应性免疫系统实现向导RNA引导Cas蛋白剪切噬菌体核酸，从而抵御噬菌体入侵，噬菌体通过Anti-CRISPR抑制细菌CRISPR-Cas系统感染细菌。尽管Anti-CRISPR以多种机制阻断CRISPR-Cas系统的功能，如干扰CRISPR-Cas复合物组装、对Cas效应蛋白进行翻译后修饰使之失活等，但目前已知的Anti-CRISPR蛋白都是通过靶向Cas蛋白来实现其抑制功能。
在该研究中，团队首先运用生化实验发现AcrIIA27蛋白结合SpCas9-sgRNA复合物可抑制底物DNA的结合，从而抑制SpCas9活性。团队通过进一步解析SpCas9-sgRNA-AcrIIA27三元复合物的高分辨率结构发现，AcrIIA27主要通过和支架sgRNA相互作用结合SpCas9-sgRNA复合物，这与之前发现的Anti蛋白都是和Cas蛋白相互作用从而抑制Cas蛋白活性的机制完全不同。团队比较SpCas9-sgRNA-DNA和SpCas9-sgRNA-AcrIIA27复合物结构发现，AcrIIA27结合在底物PAM（Protospacer Adjacent Motif）近端支架RNA Loop（该文章称之为PAM- or TAM-proximal RNA，PTP）的磷酸支架区域，而不是结合PTP RNA的碱基序列，AcrIIA27的位阻效应阻碍了底物DNA结合SpCas9（如图1），从而抑制其活性。此外，由于PTP RNA在几种亚型Cas9的支架RNA中存在，团队继续测试AcrIIA27是否能抑制不同种系来源的Cas9同源物活性，随后的生化实验证实了AcrIIA27具有抑制不同种系来源的Cas9同源物活性的能力。
图1：AcrIIA27抑制Cas9活性的分子机制
由于在几种用于基因编辑的Cas和TnpB系统中，PTP RNA保守存在（图2A），团队猜想在细胞基因编辑应用中，该研究发现的PTP RNA的磷酸骨架是否会被细胞内某些正电荷蛋白非特异性结合，从而抑制DNA底物结合，最终抑制Cas和TnpB蛋白的基因编辑活性？若该猜想成立，通过去除PTP RNA、解除未知蛋白的抑制，可提高上述系统在细胞内的基因编辑活性。
接下来的细胞内基因编辑活性实验显示，PTP RNA去除的SaCas9和FrCas9在HEK 293F细胞中不同靶基因位点的编辑效率分别是野生型的2倍和1.3倍（图2B）。更重要的是，“PTP RNA”截短策略对于具有更大支架RNA的CRISPR核酸酶系统（Cas12f、IscB等）同样适用。不仅如此，去除非CRISPR类的IS607 TnpBs（ISFba1、ISRin和ISAre）的PTP RNA（stem loop 3）后，发现它们在HEK 293F细胞中基因编辑活性得到显著提升，其中，ISFba1 TnpB系统的整体基因组编辑效率提高了2倍。团队通过脱靶分析检测发现，去除PTP RNA还可增强ISFba1 TnpB的靶向特异性。
图2A：CRISPR和TnpB系统的PTP RNA
图2B：野生型和去除PTP RNA的SauCas9以及ISFba1在人类细胞中的基因编辑效率比较
综上，该研究首先发现了Anti蛋白抑制Cas蛋白活性的全新机制，拓展了噬菌体和细菌“军备竞赛”协同进化的知识边界。此外，基于该新机制，团队提出了可提高CRISPR和TnpB类基因编辑效率的通用策略，为开发高效基因编辑工具提供了新视角与设计思路。
黄志伟教授为论文通讯作者。生命科学和医学学部博士研究生于领、尹明雨，副研究员朱玉威为论文共同第一作者。
该研究获国家重点研发计划、国家自然科学基金、中央政府引导地方科技发展资金、腾讯新基石科学基金等项目的资助。
论文链接：https://doi.org/10.1038/s41594-025-01741-z